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UMR 7286 - Centre de Recherche en Neurobiologie et Neurophysiologie de Marseille

Proteomique CAPM

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DOSAGE DE PROTEINES MEMBRANAIRES PAR SPR

Dosage des protéines membranaires par SPR

Localisées à l’interface de compartiments subcellulaires distincts, les protéines membranaires assurent des fonctions essentielles et constituent des cibles pharmacologiques primordiales. Peu abondantes, elles sont partiellement enrichies au sein de domaines spécifiques. De par leur propriété hydrophobe, ces protéines sont difficilement analysables et quantifiables par des méthodes biochimiques conventionnelles. Depuis sa création en 2000, la plate-forme CAPM/Biocapteurs s’est spécialisée dans l’étude de ces protéines et a démontré que la technologie SPR peut constituer une approche de choix pour l’analyse des protéines membranaires. En prenant comme modèle, une des protéines de la membrane des vésicules synaptiques, le protéine VAMP2, nous avons tout d’abord démontré que la présence d’un environnement lipidique influe sur la conformation et la fonction de cette protéine (De Haro, PNAS 2004).

Epitope mapping sur proteoliposomes immobilisés

Figure 1 : Epitope mapping sur proteoliposomes immobilisés

D’autre part, nous avons développé une nouvelle méthodologie dans laquelle des vésicules synaptiques intactes sont immobilisées en une seule étape sur les biopuces (Ferracci, Anal Biochem 2004). Cette configuration « vesicle chips » permet de proposer une approche simple pour l’étude protéomique différentielle et/ou fonctionnelle des composants membranaires des vésicules synaptiques et pourrait être étendue à d’autres types d’organelles.

Vésicules synaptiques immunocapturées sur sensor chip et visualisées par microscopie électronique

Figure 2 : Vésicules synaptiques immunocapturées sur sensor chip et visualisées par microscopie électronique

L’analyse SPR des taux d’immuno-capture des vésicules synaptiques permet également de proposer une nouvelle méthode de dosage extrêmement sensible de leurs composants membranaires, sans recours à la solubilisation, à partir de faibles quantités d’échantillons provenant de neurones en cultures ou coupes de cerveau (Ferracci, Biochem J 2005 ; Slezac, Neuron 2012).

Une des applications mises en œuvre sur la plate-forme est le dosage de l’activité endoprotéolytique des neurotoxines botuliques. Cette étude a été réalisée en étroite collaboration avec l’unité INSERM UMR 1072. Ces neurotoxines clostridiales sont les substances biologiques les plus toxiques connues à ce jour et agissent en inhibant la neurotransmission synaptique par action endoprotéolytique sur les protéines SNARE.

Leur utilisation croissante comme agent thérapeutique mais aussi le risque potentiel qu’elles constituent en tant qu’arme biologique, justifient l’élaboration de nouveaux tests de dosage in vitro. A partir de substrat natif, nous avons mise au point des tests in vitro utilisant la SPR comme méthode analytique pour mesurer l’activité endoprotéolytique des BoNT/A et B (Ferracci, Biochem J 2005 ; Marconi, Toxicol Appl Pharmacol 2008).

Concernant la BoNT/B, ce test s’avère être 200 fois plus sensible et jusqu’à 25 fois plus rapide que le test de référence de létalité in vivo chez la souris et permet de détecter la neurotoxine dans des fluides biologiques ou alimentaires (Ferracci, Anal Biochem 2011)

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